IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)는 유도성이 높은 β-갈락토시다제 기질의 유사체입니다.IPTG의 유도 하에서 유도인자는 억제인자 단백질과 복합체를 형성할 수 있으므로 억제인자 단백질의 형태가 변화되어 표적 유전자와 결합할 수 없게 되어 표적 유전자가 효율적으로 발현된다.그러면 실험 중에 IPTG의 농도를 어떻게 결정해야 합니까?클수록 좋은가요?
먼저 IPTG 유도 원리를 이해해보자. 대장균의 유당 오페론(요소)에는 각각 β-갈락토시다제, 퍼미아제, 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 세 가지 구조 유전자 Z,Y, A가 포함되어 있다.lacZ는 유당을 포도당과 갈락토스로 가수분해하거나 알로락토스로 분해합니다.lacY는 환경에 있는 유당이 세포막을 통과하여 세포 안으로 들어가도록 합니다.lacA는 아세틸-CoA의 아세틸기를 β-갈락토사이드로 이동시켜 독성 효과를 제거합니다.또한, 작동 서열 O, 시작 서열 P, 조절 유전자 I가 있다. I 유전자 코드는 억제 단백질로, 연산자 서열의 O 위치에 결합할 수 있어 오페론(메타)이 억제되고, 껐다.개시 서열 P의 상류에는 이화작용 유전자 활성화제 단백질-CAP 결합 부위에 대한 결합 부위도 있습니다. P 서열, O 서열 및 CAP 결합 부위는 함께 lac 오페론의 조절 영역을 구성합니다.세 가지 효소의 코딩 유전자는 동일한 조절 영역에 의해 조절되어 유전자 산물의 조화로운 발현을 달성합니다.
유당이 없으면 lac 오페론(메타)은 억제 상태에 있습니다.이때, PI 프로모터 서열의 제어를 받는 I 서열에 의해 발현되는 lac 억제인자는 O 서열과 결합하여 RNA 폴리머라제가 P 서열에 결합하는 것을 방해하고 전사 개시를 억제하며;유당이 존재하면 lac 오페론(메타)이 유도될 수 있습니다. 이 오페론(메타) 시스템에서 실제 유도자는 유당 자체가 아닙니다.유당은 세포 안으로 들어가고 β-갈락토시다아제에 의해 촉매작용을 받아 알로락토스로 전환됩니다.후자는 유도 분자로서 억제 단백질에 결합하여 단백질 형태를 변화시키며, 이는 억제 단백질을 O 서열로부터 분리하고 전사하게 합니다.이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)는 알로락토스와 동일한 효과를 갖습니다.매우 강력한 유도물질로 세균에 의해 대사되지 않고 안정성이 매우 높아 실험실에서 널리 사용됩니다.
IPTG의 최적 농도를 결정하는 방법은 무엇입니까?대장균을 예로 들어 보겠습니다.
양성 재조합 pGEX(CGRP/msCT)를 함유한 E. coli BL21 유전자 조작 균주를 50μg·mL-1 Amp가 함유된 LB 액체 배지에 접종하고 37°C에서 밤새 배양했습니다.위의 배양액을 50μg·mL-1 Amp를 1:100의 비율로 함유한 50mL 신선한 LB 액체배지 10병에 접종하여 OD600 값이 0.6~0.8이 되었을 때 최종 농도에 IPTG를 첨가하였다.0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1이다.동일한 온도, 동일한 시간에 유도한 후 균체 용액 1 mL를 취하여 원심분리로 균체를 모아 SDS-PAGE를 실시하여 IPTG 농도가 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 후, 단백질 발현이 가장 큰 IPTG 농도를 선택합니다.
실험 후에는 IPTG의 농도가 가능한 한 높지 않다는 것을 알 수 있습니다.이는 IPTG가 박테리아에 대해 특정 독성을 갖고 있기 때문입니다.농도를 초과하면 세포도 죽게 됩니다.일반적으로 세포 내 수용성 단백질이 많이 발현될수록 좋기를 바라지만, IPTG의 농도가 너무 높으면 많은 양의 내포물이 형성되는 경우가 많습니다.몸에서는 수용성 단백질의 양이 감소했지만.따라서 가장 적합한 IPTG 농도는 클수록 좋은 것이 아니라 농도가 낮을수록 좋습니다.
유전자 조작 균주의 유도 및 배양 목적은 목적 단백질의 수율을 높이고 비용을 절감하는 것입니다.표적 유전자의 발현은 균주 자체 인자 및 발현 플라스미드뿐만 아니라 유도제의 농도, 유도 온도 및 유도 시간과 같은 기타 외부 조건의 영향을 받습니다.따라서 일반적으로 미지의 단백질을 발현 및 정제하기 전에 유도 시간, 온도, IPTG 농도 등을 연구하여 적절한 조건을 선택하고 최상의 실험 결과를 얻는 것이 가장 좋습니다.
게시 시간: 2021년 12월 31일