IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)는 β-갈락토시다아제 기질의 유사체로, 유도성이 매우 높습니다. IPTG의 유도 하에, 유도제는 억제 단백질과 복합체를 형성하여 억제 단백질의 구조를 변화시키고, 결과적으로 표적 유전자와의 결합을 차단하여 표적 유전자의 효율적인 발현을 유도합니다. 그렇다면 실험에서 IPTG의 농도는 어떻게 결정해야 할까요? 농도가 높을수록 좋을까요?
먼저 IPTG 유도 원리를 이해해 보겠습니다. 대장균의 락토스 오페론(요소)은 β-갈락토시다아제, 투과효소, 아세틸전달효소를 각각 암호화하는 세 개의 구조 유전자(Z, Y, A)를 포함합니다. lacZ는 락토스를 포도당과 갈락토스 또는 알로락토스로 가수분해하고, lacY는 환경 중의 락토스가 세포막을 통과하여 세포 내로 들어오도록 하며, lacA는 아세틸-CoA에서 아세틸기를 β-갈락토시다아제로 전달하여 독성 효과를 제거합니다. 또한, 작동 서열 O, 시작 서열 P, 조절 유전자 I가 있습니다. I 유전자는 작동 서열 O 위치에 결합하여 오페론(메타)을 억제하고 비활성화하는 억제 단백질을 암호화합니다. 개시 서열 P 상류에는 이화 유전자 활성화 단백질(CAP) 결합 부위도 존재한다. P 서열, O 서열 및 CAP 결합 부위는 함께 락 오페론의 조절 영역을 구성한다. 세 가지 효소의 코딩 유전자는 동일한 조절 영역에 의해 조절되어 유전자 산물의 조화로운 발현을 이룬다.
유당이 없을 때, lac 오페론(meta)은 억제 상태에 있습니다. 이때, PI 프로모터 서열의 조절을 받는 I 서열에 의해 발현되는 lac 억제 단백질이 O 서열에 결합하여 RNA 중합효소가 P 서열에 결합하는 것을 방해하고 전사 개시를 억제합니다. 유당이 존재할 때는 lac 오페론(meta)이 유도될 수 있습니다. 이 오페론(meta) 시스템에서 실제 유도 물질은 유당 자체가 아닙니다. 유당이 세포 내로 들어가면 β-갈락토시다아제에 의해 알로유당으로 전환됩니다. 알로유당은 유도 분자로서 억제 단백질에 결합하여 단백질 구조를 변화시키고, 이로 인해 억제 단백질이 O 서열에서 분리되어 전사가 개시됩니다. 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)도 알로유당과 동일한 효과를 나타냅니다. 이는 박테리아에 의해 대사되지 않고 매우 안정적인 강력한 유도체이므로 실험실에서 널리 사용됩니다.
IPTG의 최적 농도를 어떻게 결정할까요? 대장균을 예로 들어 설명하겠습니다.
양성 재조합 플라스미드 pGEX(CGRP/msCT)를 포함하는 유전자 변형 E. coli BL21 균주를 50μg·mL⁻¹ 암피실린이 함유된 LB 액체 배지에 접종하고 37°C에서 하룻밤 배양하였다. 위의 배양액을 50mL의 새로운 LB 액체 배지(50μg·mL⁻¹ 암피실린 함유) 10병에 1:100의 비율로 접종하여 증식 배양하였다. OD₆₀₀ 값이 0.6~0.8에 도달했을 때, IPTG를 최종 농도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L⁻¹가 되도록 첨가하였다. 동일한 온도와 시간에서 유도 배양 후, 세균 용액 1mL를 채취하여 원심분리로 세균 세포를 수집하고 SDS-PAGE를 실시하여 IPTG 농도에 따른 단백질 발현 변화를 분석한 후, 단백질 발현이 가장 높은 IPTG 농도를 선택하였다.
실험 결과, IPTG의 농도는 최적이 아니라는 것을 알게 될 것입니다. IPTG는 세균에 대해 일정 수준의 독성을 가지고 있기 때문입니다. 농도가 너무 높으면 세포가 사멸할 수 있습니다. 일반적으로 세포 내 가용성 단백질 발현량이 많을수록 좋지만, IPTG 농도가 너무 높으면 오히려 다량의 봉입체가 형성되고 가용성 단백질 발현량은 감소하는 경우가 많습니다. 따라서 가장 적절한 IPTG 농도는 높을수록 좋은 것이 아니라 오히려 낮을수록 좋은 경우가 많습니다.
유전자 변형 균주의 유도 및 배양의 목적은 목표 단백질의 수율을 높이고 비용을 절감하는 것입니다. 목표 유전자의 발현은 균주 자체의 요인과 발현 플라스미드뿐만 아니라 유도제의 농도, 유도 온도, 유도 시간과 같은 외부 조건에도 영향을 받습니다. 따라서 일반적으로 미지의 단백질을 발현 및 정제하기 전에 유도 시간, 온도, IPTG 농도 등을 연구하여 적절한 조건을 선택하고 최상의 실험 결과를 얻는 것이 좋습니다.
게시 시간: 2021년 12월 31일